سپریمئر پی سی آر کے نتائج کے لئے کیا ضرورت ہے

01 صاف لیبارٹری کی شرائط

چونکہ پی سی آر ڈی این اے کے ایک انوژن کا پتہ لگانے کے قابل ہے، لیبارٹری میں قدیم حالات کو برقرار رکھنے کے لئے ضروری ہے. ہمیشہ تازہ دستانے پہنیں؛ بائنری شیشے کا استعمال، ٹیوبیں، اور پائپیٹ تجاویز استعمال کریں؛ اور کام شروع کرنے سے پہلے کام کے علاقے صاف کریں.

ہمیشہ کے لئے کنٹرول ردعمل شامل ہیں، سانچے ڈی این اے کے بغیر اور انزیم کے بغیر یہ یقینی بنانے کے لئے کہ صحیح نتائج نمونے کے لۓ صحیح نمونے کی وجہ سے ہو.

زیادہ سے زیادہ لوگ اس بات کا یقین کرتے ہیں کہ ان کے اپنے سیٹ حلیں جو دشواری کا حل آسان بنانے کے لئے مشترکہ نہیں ہیں اور صرف پی سی آر کے لئے نامزد پائپیٹیں اکثر الگ الگ ہوتے ہیں. DNase اور RNase-free پی سی آر ٹیوبیں، یروزول مزاحم پائپیٹ تجاویز، اور ایک غذائی ہڈ میں کام کرنے والے یووی روشنی کے ساتھ بھی مسائل کو کم کرنے کے طریقوں ہیں.

02 کیمیائی اجزاء

بھی اہم اہمیت میں سانچے کی پاکیزگی اور سالمیت (صاف ڈی این اے) اور پریمر ڈیزائن ہے. پرائمر ڈیزائن کرنے کے لئے آن لائن دستیاب کئی سوفٹ ویئر پروگرام موجود ہیں. بہترین پرائمری:

• 18 سے 24 اڈوں ہیں
• کوئی ثانوی ڈھانچہ نہیں ہے (مثال کے طور پر، ہیئر پیڈ لوپ)
• G / C اور A / T جوڑوں کی متوازن تقسیم ہے
• 3 فٹ کے اختتام پر ایک دوسرے سے تکمیل نہیں ہیں
• عام طور پر 55 اور 65 ڈگری سیلسیس کے درمیان درجہ حرارت درجہ حرارت کے نیچے پگھلنے کا درجہ حرارت (ٹی ایم) تقریبا 5-10 ڈگری سیلسیس ہے. دونوں پرائمریوں کے لئے TM بھی بہترین نتائج کے لئے اسی طرح ہونا چاہئے.

03 ردعمل مکس: سانچہ اور پرائمری

رد عمل کا مرکب کا تناسب پی سی آر کے نتائج کے معیار پر بہت بڑا اثر ہے. ٹیمپلیٹ، انزائم، پرائمر، اور نیوکللیٹائڈز کے استعمال کے لئے ایک عام فارمولہ موجود ہے، لیکن یہ تھوڑا سا چھوٹا جا سکتا ہے.

زیادہ سے زیادہ پریمر توجہ مرکوز 0.1 اور 0.6 مائکروومولس / ایل کے درمیان ہیں. ٹیمپلیٹ کی مقدار ڈی این اے (انسانی، بیکٹیریل، پلاسمی) کی قسم پر منحصر ہے.

ٹیمپلیٹ کی بہت کم مقدار کے ساتھ، نتائج کو بہتر بنانے کے لئے دیگر حکمت عملی موجود ہیں، جیسے سائیکل نمبروں کی تعداد یا "گرم شروع" کا استعمال. ہمیشہ نئے پرائمریوں کو مثبت کنٹرول ردعمل کے ساتھ آزمائیں، یہ یقینی بنائیں کہ وہ آپ کے مخصوص تجرباتی حالات کے تحت کام کریں.

04 ردعمل مکس: اینجیم سرگرمی

ڈی این اے پولیمیریز کا انتخاب مصنوعات کی ردعمل اور معیار کی نفاذ پر اثر انداز کرتا ہے. روایتی تاق پولیمیریز بہت زیادہ لیبز میں تبدیل کر دیا گیا ہے جس میں اعلی مخلص انزائمز (جو کم از کم غلطی کرتے ہیں) کی طرف سے ہیں.

رد عمل مرکب میں MGCl2 کی حراستی پی سی آر کے نتائج پر اثر انداز کر سکتے ہیں اور زیادہ فاسد رد عمل میں اہم کردار ادا کرسکتے ہیں. میگنیشیم کیشن ڈی این ٹی پی کے ساتھ گھلنشیل پیچیدہ فارموں کو اصل ذائقہ پیدا کرنے کے لۓ پالیمریز اینجیم تسلیم کرتی ہے.

تمام چار ڈی این ٹی ٹی کے برابر مقدار پولیمیریس کی غلطی کی شرح کو کم کرنے میں بھی مدد کرتی ہے. بعض additives جیسے بیٹن، BSA، ڈٹرجنٹ، DMSO، گلیسرول، اور پیروفاسفیسس انزمی مخصوصیت یا رد عمل کی کارکردگی کو بھی متاثر کرسکتے ہیں.

05 ٹرموائکلر کی قسم

لیبارٹری کے آلات کے لئے خریداری کرتے وقت، اس بات کو ذہن میں رکھیں کہ کچھ تھرکوائکلر صحیح، مناسب درجہ حرارت کو برقرار رکھنے میں دوسروں کے مقابلے میں کم عین مطابق ہیں.

یہ ایک ایسا علاقہ ہے جہاں آپ سستے جانے والے لمبے عرصہ میں ادا نہیں کریں گے جب آپ فکری ردعمل کا سامنا کرتے ہیں یا پرائمر استعمال کرتے ہیں جو درجہ حرارت کے درجہ حرارت کی محدود حد کی ضرورت ہوتی ہے.

تھرکوائکلر کے عین مطابق برانڈ کو فٹ ہونے کے لئے تیار پتلی دیوار شدہ رد عمل ٹیوبیں آپ ردعمل درجہ حرارت کو بہتر بنانے میں بھی مدد کرتے ہیں.

06 سائیکل کی ترتیبات

ردعمل سائیکل کی لمبائی، درجہ حرارت، اور کئی سائیکلیں، پی سی آر کام کرے گا کہ کس طرح اچھی طرح سے تعین کرنے میں تمام اہم کردار ہے. ابتدائی گرمی کا مرحلہ کافی دیر تک اس سانچے کو مسترد کرنے کے لئے کافی ہونا چاہئے اور دوبارہ دوبارہ چلنے سے پگھلنے ڈی این اے کو روکنے کے لئے سائیکل کافی لمبا ہونا ضروری ہے.

اضافی پیداوار ہر 20 سائیکل کے بارے میں توسیع کے وقت میں اضافہ کرکے زیادہ تر سانچے کو بڑھانے کے لۓ کم انزائم کے لئے معاوضہ کے لۓ حاصل کیا جا سکتا ہے. عام طور پر، 40 سے زائد سائیکلوں میں سے ایک کم از کم 10 ٹیمپلیٹ انوولوں کو اتنی بڑی تعداد میں ایک اتادیمیم برومائڈ-داغ زراعت جیل کو دیکھنے کے لئے بڑھانے کے لئے کافی ہے.